Projekt 03FMTHH15

Entwicklung eines quantenmechanischen Systems für die Gewinnung von Proben aus Geweben für die molekulare Diagnostik

Ausgangssituation und Zielsetzung

Das Hauptziel der Arbeiten am Institut für Klinische Chemie am UKE war die Entwicklung einer neuen Ablationskammer, die Optimierung der Parameter zur Freisetzung von Biomolekülen aus verschiedenen Geweben und die bioanalytische Charakterisierung der gewonnenen Aerosole. Im Rahmen des Projektes wurde eine neue, geschlossene Ablationskammer entwickelt, die zu einer effizienteren Probenahme führt und sowohl höhere als auch reproduzierbarere Proteinausbeuten liefert.

In dem FMTHH-Projekt wurde ein neues Verfahren zum Auffangen des PIRL-Aerosols mit einem Glasfaserfilter entwickelt. An der TUHH wurde für die Abscheidung in der Ablationskammer eine Halterung für den Glasfaserfilter entworfen und im 3D-Druckverfahren hergestellt. Mit der entworfenen Halterung und dem Glasfaserfilter kann das Aerosol bereits in der Ablationskammer aufgefangen werden.

Vorgehensweise

Im Rahmen einer Projektstudie wurde der Stickstofffluss, der Vakuumstrom und die Platzierung des Reaktionsgefäßes in der Kühlfalle hinsichtlich der maximalen Extraktionsausbeute von Proteinen aus Geweben optimiert. Ein Vergleich mit der vorherigen Ablationskammer zeigte, dass die neue Ablationskammer sowohl höhere als auch reproduzierbarere Proteinausbeuten liefert.
Im Rahmen einer Masterarbeit und einer Doktorarbeit wurde für verschiedene Gewebe
(Leber, Muskel, Pankreas) der Zusammenhang zwischen verschiedenen Laser-Parametern des PIRL und der Molekülausbeute analysiert. Darüber hinaus wurden die Proteinausbeuten, Enzymaktivitäten von ablatierten Protein und die Zusammensetzung des Proteoms zwischen verschiedenen Lasersystemen (PIRL und MIRL (Mikrosekunden Infrarot-Laser)) verglichen und untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden im „Journal of Proteomics“ veröffentlicht (1).
In weiteren Studien konnten innerhalb des Projektes erfolgreich gezeigt werden, dass PIRL im Vergleich zu konventionellen Methoden der Gewebeaufarbeitung einen bislang nicht möglichen Zugang zur Proteinspezieszusammensetzung von Geweben liefert. Diese Ergebnisse wurden im „Journal of Proteomics“ publiziert (2).

Da das Hauptziel der Arbeiten am Institut für Mehrphasenströmung (Prof. Dr. Michael Schlüter) der Technischen Universität Hamburg (TUHH) die Entwicklung eines Prototypen zum nahezu verlustfreien Transport des Laser-ablatierten Aerosols bei gleichzeitiger Abtrennung von größeren Gewebefraktionen war, musste zunächst eine Messtechnik entwickelt werden, die die Größenklassifizierung und die Beobachtung des Strömungsverhaltens der Aerosole während des Transports ermöglicht. Hierfür wurden Untersuchungen mit einem Long-Range-Distance Mikroskop durchgeführt sowie das am Institut vorhandene Mikro-Particle-Image-Velocimetry-System (μPIV-System) modifiziert und eingesetzt.

Für die Entwicklung eines Prototypen zur nahezu verlustfreien Gewinnung des Aerosols bei gleichzeitiger Abscheidung von größeren Gewebefragmenten unter sterilen Bedingungen wurden zunächst verschiedene Separationsverfahren anhand von Literaturdaten auf ihre Eignung untersucht und darauf basierend das Prinzip des Zentrifugalabscheiders gewählt. Der entworfene Prototyp ermöglicht zudem die Einspeisung eines Schutzgases, das sowohl die Ablationsstelle steril hält als auch die Luftfeuchtigkeit minimiert und somit das Vereisen einer nachgeschalteten Cryo-Falle verhindert.

Der Prototyp wurde in CAD erstellt und anschließend als Funktionsprototyp in einem 3D-Druckverfahren gefertigt.

Beteiligte

Dr. Marcel Kwiatkowski
Beispiel X-Projektleitung
Faculty of Mathematics & Natural Sciences Pharmacokinetics, Toxicology and Targeting
University of Groningen

Prof. Dr. Hartmut Schlüter

Mass Spectrometric Proteomics

Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin

UKE

Prof. Dr. Michael Schlüter
Projektleitung
Institut für Mehrphasenströmungen
TUHH

Publikationsliste

Vorträge auf nationalen Konferenzen

  • Cold vaporization of tissues – A better view on the protein species composition of tissue proteomes in- vivo. Kwiatkowski M. 49th annual meeting of the German Society of Mass Spectrometry (DGMS). Hamburg, 2016.
  • Moleculare diagnostics of tissues by the picosecond infrared laser ablation. Kwiatkowski M. 13th annual meeting of the German Society of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (DGKL). Rosengarten, 2016. Eingeladener Vortrag.
  • Mass Spectrometric Characterization of Proteins from condensates of the Picosecond Infrared Laser Ablation. Kwiatkowski M. 50th annual meeting of the German Society of Mass Spectrometry (DGMS). Kiel, 2017. Eingeladener Vortrag.

Vorträge auf internationalen Konferenzen

  • Protein extraction for proteomics by cold vaporization of tissues. Marcel Kwiatkowski. 42nd International Symposium on High Performance Liquid Phase Separation and Related Techniques. Geneva, 2015.
  • Better access to protein species by cold vaporization of tissues with picosecond infrared laser ablation. 45th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separation and Related Techniques. Prague, 2017.
  • Better access to protein species by cold vaporization of tissues with picosecond infrared laser ablation. 16th Human Proteome Organisation World Congress. Dublin, 2017.

Posterpräsentationen auf nationalen Konferenzen

  • Efficiency of tissue homogenization via picosecond-infrared laser (PIRL) and classical homogenization as sample preparation step for proteomics. Refat Nimer. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Massenspektrometrie. Hamburg. Deutschland, 2016.
  • A proteomic workflow for characterization of human skin biopsies by using pico-second infrared laser (PIRL). Parnian Kiani. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Massenspektrometrie. Hamburg. Deutschland, 2016.
  • Proteomic investigation of skin cell layers by tissue ablation using picosecond infrared laser (PIRL). Parnian Kiani. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Massenspektrometrie. Kiel. Deutschland, 2017.
  • Application of laser ablation for tissue metabolomics. Jonas Klein. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Massenspektrometrie. Kiel. Deutschland, 2017.

Posterpräsentationen auf internationalen Konferenzen

  • Differential proteome analysis of human neuroblastome xenograft primary tumors and matched spontaneous distant metastases. Lorena Hänel. International Mass Spectrometry Conference. Florence. Italy 2018.
  • Cold vaporization of tissues by picosecond infrared laser (PIRL) ablation – Unique access to the original proteoform composition. Marcel Kwiatkowski. International Mass Spectrometry Conference. Florence. Italy 2018.

Aus dem Projekt sind die folgenden Publikationen hervorgegangen

  • (1) Sampling of Tissues with Laser Ablation for bottom-up Proteomics: Comparison of Picosecond Infrared Laser (PIRL) and Microsecond Infrared Laser (MIRL). Krutilin A, Maier S, Schuster R, Kruber S, Kwiatkowski M, Robertson WD, Miller DRJ, Schluter H. Journal of Proteome Research. Just accepted. DOI: 10.1021/acs.jproteome.9b00009
  • (2) Homogenization of human tissues via picosecond-infrared laser (PIRL) ablation: Giving a closer view on the in-vivo composition of protein species as compared to mechanical homogenization. Kwiatkowski M, Wurlitzer M, Kiani P, Nimer R, Omidi M, Bußmann T, Bartkowiak K, Kruber S, Uschold S, Steffen P, Lübberstedt J, Küpker N, Petersen H, Knecht R, Hansen NO, Robertson WD, Miller RJD, Schlüter H. J Proteomics. 2016. 134:193-202.
  • (3) Differential Proteome Analysis of Human Neuroblastoma Xenograft Primary Tumors and Matched Spontaneous Distant Metastases. Hänel L, Gosau T, Maar H, Valentiner U, Schumacher U, Riecken K, Windhorst S, Hansen N-O, Heikaus L, Wurlitzer M, Nolte I, Schlüter H, Lange T. Scientific Report. 2018. 8(1):13986
  • (4) Mass Spectrometry Based Intraoperative Tumor Diagnostics. Hänel L, Heiklaus L, Kwiatkowski M, Schlüter H. Future Science OA. 2019.

Aus dem Projekt ist folgender Preis hervorgegangen

  • Wolfgang Paul Studienpreis“ der Deutschen Gesellschaft für Massenspektrometrie für herausragende Arbeiten auf dem Gebiet der Massenspektrometrie. Dr. Marcel Kwiatkowski. 2017.